A pirazolotriazina pseudoiodinina natural de Pseudomonas mossselii 923 inibe patógenos bacterianos e fúngicos de plantas

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 734 (2023) Citar este artigo

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Os produtos naturais amplamente produzidos por microrganismos do solo semelhantes a Pseudomonas são uma fonte consistente de metabólitos antimicrobianos e pesticidas. Aqui nós relatamos o isolamento da estirpe 923 de Pseudomonas mossselii de solos de rizosfera de arroz de campos de arroz, que inibem especificamente o crescimento de patógenos vegetais Xanthomonas espécies e o patógeno fúngico Magnaporthe oryzae. O composto antimicrobiano é purificado e identificado como pseudoiodinina usando espectros de massa de alta resolução, ressonância magnética nuclear e difração de raios X de cristal único. Mutagênese aleatória em todo o genoma, análise de transcriptoma e ensaios bioquímicos definem o cluster biossintético de pseudoiodinina como psdABCDEFG. A biossíntese da pseudoiodinina é proposta para iniciar a partir do trifosfato de guanosina e 1,6-didesmetiltoxoflavina é um intermediário biossintético. A mutagênese do transposon indica que GacA é o regulador global. Além disso, dois pequenos RNAs não codificantes, rsmY e rsmZ, regulam positivamente a transcrição de pseudoiodinina, e os reguladores de armazenamento de carbono CsrA2 e CsrA3, que regulam negativamente a expressão de psdA. Um aumento de 22,4 vezes na produção de pseudoiodinina é obtido otimizando o meio usado para fermentação, superexpressando o operon biossintético e removendo os locais de ligação de CsrA. Tanto a cepa 923 quanto a pseudoiodinina purificada in planta inibem os patógenos sem afetar o hospedeiro do arroz, sugerindo que a pseudoiodinina pode ser usada para controlar doenças de plantas.

O arroz (Oryza sativa L.) é uma cultura básica de importância mundial e é considerada uma cultura estratégica para a segurança alimentar pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO)1; infelizmente, a produção de arroz é dificultada por várias restrições, incluindo doenças devastadoras, como queima bacteriana das folhas (BLB), estrias bacterianas das folhas (BLS) e brusone do arroz, que são incitadas por Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), X. oryzae pv. oryzicola (Xoc) e Magnaporthe oryzae, respectivamente2,3. Atualmente, o cultivo de variedades de arroz com genes de resistência a doenças (R) parece ser a melhor opção para controlar X. oryzae do que outros esquemas de manejo2,4; no entanto, cultivares plantadas na China são comumente suscetíveis aos patógenos5. Embora fungicidas e bactericidas químicos sejam freqüentemente usados para controlar doenças do arroz6, seu uso resultou em poluição, resistência a drogas e ressurgimento de patógenos7,8. Uma abordagem de controle ambientalmente amigável é o uso potencial de bactérias antagonistas como agentes de biocontrole (BCAs) que podem suprimir patógenos produzindo metabólitos secundários bioativos, incluindo antibióticos, sideróforos e compostos voláteis9.

Produtos naturais (NPs) são uma fonte consistente de metabólitos antimicrobianos e chumbo de drogas e são amplamente produzidos por microorganismos que vivem no solo10,11. As espécies de Pseudomonas são bactérias gram-negativas que persistem no solo, na água, nos animais e na rizosfera vegetal. Pseudomonas produzem muitos NPs antimicrobianos, incluindo fenazina, derivados de pirrol, 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG) e substâncias promotoras de crescimento, que os tornam bem adaptados ao estresse ambiental e adequados como BCAs de patógenos de plantas12. Muitos metabólitos secundários em Pseudomonas são regulados pelo sistema de dois componentes GacS/GacA (TCS)13, pequenos RNAs não codificantes (sRNAs) e proteínas CsrA/RsmA14. Com o advento do sequenciamento genômico, vários antimicrobianos foram descobertos no microbioma global15 com benefícios para a agricultura moderna16 e para a saúde humana17. No entanto, o desenvolvimento contínuo de patógenos multirresistentes18 aumentou a urgência para descobrir novos NPs para controlar doenças bacterianas e fúngicas de culturas.

Membros da família de heterociclos naturais pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazina foram isolados e caracterizados nos últimos 40 anos19, incluindo fluviols20, nostocina A21 e pseudoiodinina22. A estrutura pseudoiodinina contém uma porção 1,2,4-triazina fundida com um anel pirazol e dois grupos metil. Derivados da família da pirazolotriazina exibem uma ampla gama de funções biológicas, incluindo atividades antitumoral, antiviral e antibacteriana23,24. Em particular, a pseudoiodinina exibiu fortes atividades antineoplásicas contra o sarcoma25. Curiosamente, a rota biossintética e os agrupamentos de genes biossintéticos (BGCs) da pseudoiodinina não foram elucidados e continuam sendo um rico recurso para a biologia sintética e o desenvolvimento de derivados bioativos.

0.05). e, f Disease lesions areas on field-grown rice inoculated with strain 923 and (e) Xoo PXO99A or (f) Xoc RS105. Lesion areas were determined at 15 dpi (n = 15 independent leaves, means ± SD), ***P < 0.001, ***P = 1.2×10−15, = 1.3×10−14 in sequence of e; ***P < 0.001, ***P = 4.7 × 10−13, = 3.2 × 10−11 in sequence of f; ns, not significant (P > 0.05). The statistical significance of the lesion areas inoculated with Xoc or Xoo was determined using the LSD test method and one-way ANOVA; The center bar represents the mean, and Min to Max of box and whiskers was used. The experiments were repeated three times independently with similar results./p>

5 μM caused a significant reduction in lesion size (Supplementary Fig. 3b, c), indicating that pseudoiodinine effectively inhibits the growth of Xoo PXO99A and Xoc RS105 in rice tissue. Interestingly, we observed that pseudoiodinine also significantly reduced lesion area of rice blast caused by the fungus M. oryzae R01-1 (Supplementary Fig. 12). The above data demonstrate that the compound is a promising biopesticide both for bacterial and fungal diseases in rice./p>

5 μM (Supplementary Fig. 3b, c)./p> 50%. The whole genome of 923 was sequenced using the Illumina Miseq PacBio sequencing platform at Personalbio (Shanghai, China). Average nucleotide identity (ANI) values were calculated using the J Species WS online service64. To determine the precise phylogenetic position of strain 923, all publicly available Pseudomonas genome sequences and related strains were retrieved from the NCBI GenBank database and included in the phylogenetic analyses according to the Type Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz.de). The whole-genome sequence of strain 923 was deposited in the NCBI BioProject Database (BioProject ID: PRJNA826312)./p>100/plate). Above inoculation experiments were repeated three times independently./p>Tnp Transposome™ Kit (Lucigen, TSM08KR) was electroporated into 923 competent cell, then screening mutants that absolutely losing or partially attenuated antagonistic activity against Xoo PXO99A. The rescued cloning of the EZ-Tn5 < R6Kγori/KAN-2> Transposon insertion site in the 923 genomic DNA was given according to the manufacturer's protocols./p>

1 were used to establish significance. Volcano plots were created using the R language ggplots2 package and plot_volcano from soothsayer (https://github.com/jolespin/soothsayer) in Python v. 3.6.6. Heatmaps were produced by R language and the Pheatmap software package (https://rdrr.io/cran/pheatmap/). Euclidean and complete linkage methods were used to calculate distance and clustering, respectively./p>