Ratos sem o PSD | Grupo de patch cords Jilin

Scientific Reports volume 5, Número do artigo: 16410 (2015) Citar este artigo

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A ubiquitinação de proteínas tem uma influência significativa em diversos aspectos do desenvolvimento e função neuronal. Dorfin, também conhecida como Rnf19a, é uma ubiquitina ligase E3 do dedo RING implicada na esclerose lateral amiotrófica e na doença de Parkinson, mas suas funções in vivo não foram exploradas. Relatamos aqui que Dorfin é um novo parceiro de ligação da proteína de andaime pós-sináptica excitatória PSD-95. Camundongos mutantes Dorfin (Dorfin−/−) apresentam neurogênese adulta reduzida e potencialização de longo prazo aumentada no giro denteado do hipocampo, mas potencialização de longo prazo normal na região CA1. Comportamentalmente, os camundongos Dorfin-/- apresentam condicionamento de medo contextual prejudicado, mas níveis normais de condicionamento de medo, extinção do medo, aprendizado e memória espacial, memória de reconhecimento de objetos, memória de trabalho espacial e separação de padrões. Usando uma abordagem proteômica, também identificamos várias proteínas cujos níveis de ubiquitinação são diminuídos no cérebro Dorfin−/−. Esses resultados sugerem que Dorfin pode regular a neurogênese adulta, a plasticidade sináptica e a memória contextual do medo.

A ubiquitinação de proteínas regula diversos aspectos do desenvolvimento e função neuronal. As ligases de ubiquitina E3, que chegam a centenas (~ 400-500 em camundongos e humanos), são componentes-chave do sistema de ubiquitinação de proteínas, desempenhando papéis importantes na determinação da especificidade do substrato. A ubiquitinação de proteínas é conhecida por levar à degradação de proteínas pelo proteassoma 26S; no entanto, evidências acumuladas indicam que ele também desempenha funções adicionais, como regulação da função da proteína, tráfego e localização subcelular, bem como interações proteína-proteína.

A ubiquitinação de proteínas no sistema nervoso regula diferentes estágios do desenvolvimento neuronal, incluindo neurogênese, migração, neuritogênese e sinaptogênese1,2,3,4,5. Além disso, acredita-se que a ubiquitinação de proteínas sinápticas regule diversos aspectos da estrutura, função e plasticidade sinápticas. Os substratos conhecidos da ubiquitinação sináptica incluem proteínas de andaimes/adaptadores, receptores e moléculas de sinalização. Exemplos específicos e ligases E3 relacionadas incluem PSD-95–Mdm26, GKAP/SAPAP–Trim37,8, Shank/ProSAP7, SPAR–βTRCP9,10, AKAP79/1507, Homer-1a11, CaMKIIα12, liprin-α1–APC/C13,14 , efexina-5–Ube3A15, Arc–Ube3a/Triad3a16,17, receptores AMPA (AMPARs)–Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22, receptores NMDA (NMDARs)–Mib223, mGluR1α –Siah1A24,25, mGluR5–Siah1A25, receptores GABAA (subunidade γ2)26,27, Munc13-1–Fbxo4528, RIM1–SCRAPPER29 e Piccolo/Fagote–Siah1A30.

Dorfin, uma ubiquitina ligase E3 do dedo RING, foi originalmente identificada como um componente do corpo XY dos espermatócitos e centrossomos31. Dorfin (840 aminoácidos de comprimento em camundongos) contém dois domínios RING flanqueando o domínio do anel intermediário (IBR) e dois domínios transmembranares, embora a topologia precisa da membrana da proteína não esteja bem estabelecida. Estudos anteriores implicaram o Dorfin na esclerose lateral amiotrófica familiar (ALS) e na doença de Parkinson32,33,34,35,36,37,38,39,40. Em apoio a um papel neuroprotetor para Dorfin na ELA, Dorfin ubiquitina a proteína SOD1 (superóxido dismutase 1) mutante associada à ELA33 e, quando superexpressa em um modelo de camundongo de ELA familiar, reduz a quantidade de proteínas SOD1 mutantes e suprime os fenótipos neurológicos e motor morte neuronal40. No entanto, pouco se sabe sobre as funções de Dorfin no cérebro normal, incluindo suas interações proteína-proteína, proteínas substrato e consequências funcionais da ubiquitinação de proteínas substrato. Além disso, as funções in vivo de Dorfin não foram exploradas usando abordagens de nocaute de genes.

No presente estudo, descobrimos que Dorfin interage com a abundante proteína de andaime pós-sináptica excitatória PSD-95. Camundongos Dorfin-/- mostram neurogênese adulta suprimida e potencialização de longo prazo aumentada (LTP) no giro denteado (DG) e condicionamento de medo contextual prejudicado, sugerindo que Dorfin é importante para neurogênese adulta, plasticidade sináptica e aprendizado e memória.

60%; ++, 30–60%;, +, 10–30%; −, no significant growth. (C) Pull down of full-length PSD-95 family proteins and control PDZ proteins (S-SCAM and GRIP2) by GST-Dorfin fusion proteins. GST-Dorfin (aa 834–840; WT and I840A), or GST alone, was used to bring down the indicated proteins expressed in HEK293T cells, followed by immunoblotting. (D,E) Coimmunoprecipitation of Dorfin with PSD-95 or SAP97. HEK293T cells doubly transfected with Flag-Dorfin (full length; WT or Δ3 missing the last three aa residues) and PSD-95, or SAP97, were immunoprecipitated (IP) with Flag antibodies and immunoblotted with the indicated antibodies./p>2.5 folds in the Dorfin−/− hippocampus relative to WT controls (see also Supplementary Table 1). Green circles indicate the proteins whose expression levels were tested by immunoblot of hippocampal lysates (see also Fig. 7H). (C–G) Dorfin forms a complex with five selected proteins from the list in Fig. 7B. HEK293 cells doubly expressing Myc-Dorfin and the indicated proteins were immunoprecipitated and immunoblotted with Myc or EGFP antibodies. Rab11b (C), NFM (D), PPP1CA (E), PPP1CB (F) and H2AFZ (G). Input, 5%. (H) Protein expression levels in the Dorfin−/− hippocampus (2–3 months) relative to those in WT controls, as determined by the immunoblot analysis of whole hippocampal lysates, the crude synaptosomal (P2) hippocampal fraction and microdissected whole DG lysates. (s.e.m., n = 3–6 for WT and KO hippocampi)./p>2.5 fold) in the Dorfin−/− brain relative to WT controls (Supplemental Table S1). These proteins could be classified into several functional groups, including adhesion molecules/extracellular matrix, adaptor/scaffolds, G protein-related proteins, phosphatases, proteases, enzymes and cell cycle/chromatin regulatory proteins (Fig. 7B)./p>2.5-fold in Dorfin−/− mice might provide some starting points. Indeed, many of these proteins are enriched in the postsynaptic density (PSD) and have been implicated in the regulation of excitatory synaptic transmission, synaptic plasticity and learning and memory (Supplemental Table S1). For example, Rab11a/b promotes translocation of recycling endosomes into dendritic spines and local exocytosis of GluA1 during LTP74,75,76,77. Therefore, Dorfin-dependent ubiquitination and degradation of Rab11a/b proteins would negatively regulate LTP. In addition, transgenic mice in which the signaling adaptors 14-3-3η and 14-3-3ζ are functionally inhibited by genetic expression of an inhibitor protein display reductions in synaptic content of NMDARs, NMDAR-mediated synaptic transmission, LTP and contextual fear conditioning78, suggesting that 14-3-3η and 14-3-3ζ positively regulate synaptic plasticity and learning and memory. Therefore, these functions may be suppressed by Dorfin-dependent 14-3-3 protein degradation./p>